李时珍的家世代有医业，祖父是“铃医”，父亲名闻，号月池，是当地一位知名的医生。在那个时代，民间的医生地位很低，他们常受官绅的欺凌。为了改变这一局面，父亲决定让二儿子李时珍读书应考，以便在将来能出人头地。李时珍自幼体弱多病，但性格刚直纯真，对于那些乏味透顶的八股文，他始终学不进去。当他十四岁中秀才后，又过了九年，在武昌三次参加举人考试，都未能成功。他于是放弃了科举仕途的梦想，而选择专心学习医学。
李时珍向父亲表达了他的决心：“身如逆流船，心比铁石坚。我希望您支持我的选择，无论未来遇到何种困难。”最终，他说服了父亲同意他的要求，并从父亲那里接受了精心指导。不久之后，李时珍就成了一位非常有声望的大夫。在三十八岁那年，他被楚王召见，被任命为王府中的“奉祠正”，同时负责管理良医所的事务。三年后，他又被推荐到京城担任太医院判事。这是一家专门为宫廷服务的医疗机构，当时因一些庸醫弄得乌烟瘴气。但只工作了一年，就因为对这些情况感到沮丧而辞职返回故乡。
在这段时间里，李时珍阅读了大量古代医学文献，并且通过临床实践发现，那些古老本草书籍中的记载繁杂，不仅品种很多，而且名称混乱，有时候一物分析为二三，有时候两物混为一品（《明外史本传》）。尤其是许多毒性药材，被误认为可以“久服延年”，导致滥用和危害无穷。他决定要重新编纂一部全新的本草书籍。
因此，在31岁的时候，他开始着手准备这个项目。他深入研究各种参考资料，从家族图书馆借阅、利用行医机会向富户借阅，还在成为武昌楚王府和北京太医院的一员期间进一步扩大了他的知识库。他曾自述自己“长耽嗜典籍，如啖蔗饴”（《本草纲目》原序）。顾景星在《李时珍传》中评价他：“读万卷书，不出户庭；博学无所弗瞡。”
尽管如此，这个任务仍然充满挑战，因为药材名称之多，使得人们难以辨识到底是什么东西。而且每一种药材都有其独特的地方，所以需要进行详细调查。此外，由于古代各家的解释相互矛盾，而且缺乏实际经验，因此无法得到准确答案，比如远志这个药材，它究竟是小草还是大青？有些地方把它描述成麻黄，其颜色青开白花；宋朝马志却认为它象大青，更责怪陶弘景根本不知道远志的情况一样。类似这样的问题还有狗脊，一些说它像萆薢，有些说像拔葜，有些甚至说像贯众，说法不统一。
为了解决这些问题，经过亲人的启示和自己的努力探索，最终形成了解决方案：既要广泛搜集资料，也要亲身体验实践。这就是著名的人称为“走访四方”的过程，其中包括采访农民、工匠以及其他专业人员获取信息，同时也会直接观察和收集药物标本。
例如，当他想要了解关于芸苔这个药物的时候，只凭过去的文献是不够理解其形态与用途的地步。一位种菜老人指点迷津，让他明白芸苔其实就是油菜，这样就能够更清晰地记录下这一部分内容。在四处采访中或是在自己的园子里观察植物生长，以及如何正确处理它们也是重要的一环。比如蕲蛇，即蕲州产的小白花蛇，这个药材虽然使用频繁，但由于前人的描述模糊，不知道具体该怎么看待。而通过捕捉者提供的情报以及亲眼见证整个捕捉过程，可以更加准确无误地介绍蕲蛇及其制备方法等信息。
此外，还有一例鲮鲤，即今天说的穿山甲，这是一个常用的中药，但是陶弘景提到的水陆两栖、死状装饰蚂蚁再潜水吃蚂蚁的问题一直存在争议。为了验证这一点是否属实，李时珍亲自上山去观察并帮助樵夫猎人捉到了穿山甲，从其胃内取出了一个升左右大小的蚂蚁，以此证明陶弘景的话有一定的道理。不过从观察中发现穿山甲食蚁并不完全符合陶弘健描述，而是先搔开蚂蟻穴，然后舐食，再不是诱使入甲然后潜水吞食，因此纠正了一部分错误之处。
最终，在万历戊寅年的完成之后，《本草纲目》以约190万字五十二卷正式问世，其中收录了一千八百九十二种药物、三百七十四新添加种类、一万多个方剂及附图数千幅，为中国医学领域留下了一笔巨大的财富，其中还包含对前人的许多错误进行了修正，并在动植物分类学等方面做出了重大贡献。此作品不仅代表着作者对自然界深厚兴趣，也反映出他对于科学精神追求严谨性的执着追求。
